10 Falhas Fundamentais do Teste para a COVID-19

0
2457
10 Falhas Fundamentais do Teste para a COVID-19
10 Falhas Fundamentais do Teste para a COVID-19

Resumo

Na publicação intitulada “Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR” (Eurosurveillance 25 (8) 2020), [1] os autores apresentam o protocolo RT-qPCR para detecção e diagnóstico de nCoV 2019 (agora conhecido como SARS-CoV-2), que afirmam ter sido validado, além de ser uma metodologia de diagnóstico robusta para uso em ambientes de laboratório de Saúde pública.

À luz de todas as consequências resultantes desta mesma publicação para as sociedades em todo o mundo, um grupo de pesquisadores independentes realizou uma revisão ponto por ponto da publicação mencionada em que 1) todos os componentes do design de teste apresentado foram verificados, 2) Foram avaliadas as recomendações acerca de boas práticas laboratoriais para o protocolo RT-qPCR e 3) Foram examinados os parâmetros apresentados, em comparação com a literatura científica relevante que cobre o campo. [29]

O protocolo RT-qPCR publicado para detecção e diagnóstico de 2019-nCoV e o respectivo manuscrito sofrem de vários erros técnicos e científicos, incluindo um insuficiente design do Primer, um protocolo RT-qPCR problemático e insuficiente e a ausência de uma validação de teste precisa. Nem o teste apresentado nem o manuscrito em si atendem aos requisitos para uma publicação científica aceitável. Além disso, não são mencionados conflitos sérios de interesse dos autores. Finalmente, o prazo muito reduzido entre a submissão e a aceitação da publicação (24 horas) significa que um processo de revisão sistemática por pares não foi realizado, ou, caso tenha sido feito, terá sido de qualidade muito reduzida.

O grupo de investigadores fornece evidências convincentes de várias inadequações, erros e falhas científicas. Tendo em conta as imperfeições científicas e metodológicas aqui apresentadas, o grupo acredita que o conselho editorial do Eurosurveillance não tem outra escolha senão retratar a publicação.

Relatório de Revisão Conciso

Este artigo irá mostrar várias falhas graves no artigo de CormanDrosten, cuja importância conduziu, em todo o mundo, a diagnósticos errados de infecções atribuídas ao SARS-CoV-2 e associadas à doença COVID-19. Fomos e somos confrontados com restrições severas que destruíram muitas vidas e meios de subsistência, acesso limitado à Educação e essas restrições impostas por governos em todo o mundo são um ataque directo aos direitos básicos das pessoas e as suas liberdades pessoais, resultando em danos colaterais para economias inteiras numa escala global.

Existem dez problemas fatais no artigo de CormanDrosten, que serão delineadas e explicadas em detalhe nas secções seguintes.

O primeiro e principal problema é que o novo Coronavirus SARS-CoV-2 (na publicação denominada 2019-nCoV e em Fevereiro de 2020 denominado SARS-CoV-2 por um consórcio internacional de especialistas em vírus) é baseado em sequências in silico (teóricas), fornecido por um laboratório na China [1], porque na época não havia nenhum material de controlo do SARS-CoV-2 infeccioso (“vivo”) ou inativado nem RNA genómico isolado do vírus à disposição dos autores. Até ao momento, não houve qualquer validação pelos autores baseada em vírus SARS-CoV-2 isolados ou na extensão total do seu RNA.

De acordo com Corman et al. (2020): “O nosso objetivo era desenvolver e implantar metodologia de diagnóstico robusta para uso em ambientes de laboratório de saúde pública sem ter material de vírus disponível.” [1]

O foco aqui deve ser colocado nos dois objetivos declarados: a) desenvolvimento e b) implantação de um teste de diagnóstico para uso em laboratórios de Saúde pública. Esses objetivos não são alcançáveis sem se possuir qualquer material viral real disponível (por exemplo, para determinar a carga viral infecciosa). Em qualquer caso, apenas um protocolo com precisão máxima pode ser o objetivo principal e obrigatório em qualquer cenário desta magnitude. A determinação da carga viral crítica é uma informação obrigatória e é responsabilidade do grupo de Christian Drosten realizar esses experiências e fornecer os dados cruciais.

No entanto, foram utilizadas sequências in silico para desenvolver uma metodologia de teste de RT-PCR para identificar o referido vírus. Este modelo foi baseado no pressuposto de que o novo vírus é muito semelhante ao SARS-CoV de 2003 (doravante denominado SARS-CoV-1), pois ambos são beta-coronavírus.

O teste de PCR foi, portanto, projectado utilizando a sequência genómica do SARS-CoV-1 como material de controlo para o componente Sarbeco. Sabemos disso através da comunicação por mail do grupo [2] com um dos co-autores do artigo CormanDrosten. Este método para modelar SARS-CoV-2 foi descrito no artigo CormanDrosten da seguinte forma: [1]

“O estabelecimento e validação de um fluxo de trabalho de diagnóstico para triagem de nCoV 2019 e confirmação específica, foi projectado na ausência de isolados de vírus disponíveis ou amostras originais de pacientes. O design e a validação foram possibilitados pela estreita relação genética com o SARS-CoV de 2003 e auxiliados pelo uso da tecnologia de ácido nucleico sintético.”

Em suma, um projeto baseado apenas em parentes genéticos próximos não cumpre o objectivo de um “teste diagnóstico robusto”, visto que a reactividade cruzada e, portanto, ocorrerão inevitavelmente resultados falso-positivos.

A validação foi feita apenas em relação às sequências in silico (teóricas) e no ambiente de laboratório, e não conforme exigido para o diagnóstico in vitro com RNA viral genómico isolado. Este facto não se alterou mesmo após 10 meses da introdução do teste nos diagnósticos de rotina.

Existem vários outros erros científicos graves em relação ao design biomolecular dos Primers, o método de PCR, bem como a validação molecular dos produtos e métodos de PCR descritos no artigo CormanDrosten são examinados em detalhe no restante deste artigo. O próprio artigo já indica que um grande número de resultados falso-positivos são gerados por este teste, mesmo em condições laboratoriais controladas, tornando-o completamente inadequado como um método confiável de triagem de vírus para populações inteiras numa pandemia em curso. Dadas as implicações de longo alcance, incluindo medidas de quarentena, bloqueios, toques de recolher e impactos na educação, etc., o artigo deve ser retirado imediatamente.

Erros no Design e no RT-PCR

A Reação em Cadeia da Polimerase de Transcrição Reversa (RT-PCR) é uma tecnologia biomolecular importante para detectar rapidamente fragmentos de RNA raros, que são conhecidos de antemão. Na primeira etapa, as moléculas de RNA presentes na amostra são transcritas reversamente para produzir cDNA. O cDNA é então amplificado na reação em cadeia da polimerase usando um par de iniciadores específicos (Primers) e uma enzima polimerase de DNA termoestável. A tecnologia é altamente sensível e o seu limite de detecção é teoricamente 1 molécula de cDNA. A especificidade da PCR é altamente influenciada por erros de projecto biomolecular.

O que é importante ao projetar um teste RT-PCR e o teste quantitativo RT-qPCR descrito na publicação Corman-Drosten?

1. Os Primers e sondas:

a) A concentração de Primers e sondas deve estar no intervalo ideal (100-200 nM);
b) Deve ser específica para o gene-alvo que se deseja amplificar;
c) Deve ter uma percentagem ideal de conteúdo de GC em relação ao total de bases nitrogenadas (mínimo 40%, máximo 60%);
d) Para diagnóstico de vírus, pelo menos 3 pares de Primers devem detectar 3 genes virais (de preferência o mais distante possível no genoma viral).

2. A temperatura na qual todas as reações ocorrem:

a) Temperatura de fusão do DNA (> 92 °);
b) Temperatura de amplificação do DNA (específico para TaqPol);
c) Tm: a temperatura de recozimento (a temperatura na qual os Primers e sondas alcançam a ligação / separação alvo, não deve exceder 2˚C por par de Primer). Tm depende fortemente do conteúdo de GC dos Primers.

3. O número de ciclos de amplificação (menos de 35; de preferência 25-30 ciclos); No caso de detecção de vírus, > 35 ciclos detecta apenas sinais que não se correlacionam com o vírus infeccioso, conforme determinado pelo isolamento em cultura de células [2]; se alguém for testado por PCR como positivo quando é utilizado um limite de 35 ciclos ou superior (como é o caso na maioria dos laboratórios na Europa e nos EUA), a probabilidade de que essa pessoa esteja realmente infectada é inferior a 3%, a probabilidade de que dito resultado é um falso positivo é de 97%. [3]

4. Validações biológicas moleculares: os produtos de PCR amplificados devem ser validados executando os produtos num gel e com uma régua de DNA ou por sequenciamento directo de DNA.

5. Devem ser especificados controlos positivos e negativos para confirmar / refutar a detecção de vírus específicos.

6. Deve haver um Procedimento Operacional Padrão (POP) disponível, que especifique inequivocamente os parâmetros acima, de forma que todos os laboratórios sejam capazes de configurar exactamente as mesmas condições de teste. É essencial possuir um POP universal validado, pois permite a comparação de dados dentro e entre países.

Problemas menores no artigo de Corman-Drosten

1. Na Tabela 1 do artigo de CormanDrosten, são indicadas diferentes abreviações – “nM” é especificado, mas “nm” não é. Além disso, em relação à nomenclatura correcta, nm significa “nanómetro”, portanto, nm deveria ler-se nM.

2. É consenso geral escrever sequências genéticas sempre na direção 5′-3′, incluindo os Primers reversos. É altamente incomum fazer o alinhamento com a escrita complementar reversa da sequência do Primer, como os autores fizeram na Figura 2 do artigo CormanDrosten. Além disso, é marcada uma base oscilante como “y” sem descrição das bases que o Y representa.

3. Há duas armadilhas sinuosas no artigo de CormanDrosten: A Tabela 1 não inclui valores Tm (valores de temperatura de recozimento), nem mostra valores GC (número de G e C nas sequências como valor de % de bases totais).

Problemas mais graves no artigo de Corman-Drosten

a) Pano de Fundo

Os autores apresentam os antecedentes de seu trabalho científico como: “O surto do novo coronavírus em curso (2019-nCoV) representa um desafio para os laboratórios de Saúde pública, pois os isolados de vírus não estão disponíveis enquanto há evidências crescentes de que o surto está mais disseminado do que se pensava inicialmente, e já está a ocorrer uma difusão internacional através dos viajantes.”

De acordo com a BBC News [4] e o Google Statistics [5], houve 6 mortes em todo o mundo em 21 de janeiro de 2020 – o dia em que o manuscrito foi submetido. Porque é que os autores assumiram um desafio para os laboratórios de Saúde pública, enquanto ainda não havia evidências substanciais à época, para indicar que o surto era mais disseminado do que se pensava inicialmente?

Como objetivo, os autores declararam desenvolver e implantar metodologia de diagnóstico robusta para uso em ambientes de laboratório de Saúde pública sem ter material de vírus disponível. Além disso, reconhecem que “O presente estudo demonstra a enorme capacidade de resposta alcançada através da coordenação de laboratórios académicos e públicos em redes de pesquisa nacionais e europeias”.

b) Métodos e Resultados

1. Os Primers e Sondas:

1a) Concentrações de Primer erradas

Protocolos de teste de PCR confiáveis e precisos são normalmente projectados para utilizar entre 100 nM e 200 nM por Primer. [7] No artigo CormanDrosten, observamos concentrações de Primer incomumente altas e variáveis para vários Primers (Tabela 1). Para os pares de iniciadores RdRp_SARSr-F e RdRp_SARSr-R, são descritos 600 nM e 800 nM, respectivamente. Da mesma forma, para o conjunto de Primers N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R, aconselham 600 nM e 800 nM, respectivamente. [1] Deve ficar claro que essas concentrações são muito altas para serem ideais para amplificações específicas de genes-alvo. Não existe nenhuma razão especificada para usar essas concentrações extremamente altas de Primers neste protocolo. Em vez disso, essas concentrações levam ao aumento de ligação inespecífica e à amplificação do produto de PCR.

Tabela 1: Primers e Sondas (adaptado do artigo Corman-Drosten; são destacadas as concentrações errôneas de primers)
Tabela 1: Primers e Sondas (adaptado do artigo Corman-Drosten; são destacadas as concentrações errôneas de Primers)

1b) Sequências de Primers e sondas não especificadas (“Wobble“=”Instável“)

Para obter resultados reproduzíveis e comparáveis, é essencial definir distintamente os pares de Primers. No trabalho de CormanDrosten observamos seis posições não especificadas, indicadas pelas letras R, W, M e S (Tabela 2). A letra W significa que nesta posição pode haver um A ou um T; R significa que pode haver um G ou um A; M indica que a posição pode ser A ou C; a letra S indica que pode haver um G ou um C nesta posição.

Este grande número de variantes não apenas é incomum, mas também é altamente confuso para os laboratórios. Estas seis posições não especificadas podem facilmente resultar na concepção de várias sequências alternativas de Primers que não se relacionam com o SARS-CoV-2 (2 Primers RdRp_SARSr_F distintos + 8 sondas RdRp_SARS_P1 distintas + 4 RdRp_SARSr_R distintas). As variações do projecto conduzirão inevitavelmente a resultados que não estão relacionados ao SARS-CoV-2. Portanto, a descrição inespecífica e confusa no artigo de CormanDrosten não é adequada como um protocolo operacional padrão. Essas posições não especificadas deveriam ter sido projectadas de forma inequívoca.

Essas sequências instáveis já criaram mal-estar na área e resultaram numa Carta ao Editor da autoria de Pillonel et al. (2020) [8] sobre erros flagrantes nas sequências descritas. Esses erros são evidentes tabém no suplemento de Corman et al. (2020). [1]

Tabela 2: Primers e Sondas (adaptado do artigo de Corman-Drosten; são destacados os nucleotídeos não especificados ("Instável") nos Primers)
Tabela 2: Primers e Sondas (adaptado do artigo de Corman-Drosten; são destacados os nucleotídeos não especificados (“Instável”) nos Primers)

O protocolo da OMS (Organização Mundial de Saúde) (Figura 1), que deriva directamente do artigo de CormanDrosten, conclui que, para confirmar a presença de SARS-CoV-2, devem ser identificados no ensaio dois genes de controlo (os genes E e RdRp). Deve notar-se que o gene RdPd tem uma posição incerta (“Instável“) no Primer directo (R = G / A), duas posições incertas no Primer reverso (R = G / A; S = G / C) e tem três posições incertas na sonda RdRp (W = A / T; R = G / A; M = A / C). Assim, podem ser sintetizados para o gene RdPd dois Primers directos diferentes, quatro Primers reversos diferentes e oito sondas distintas. Juntos, existem 64 combinações possíveis de Primers e sondas!

O artigo CormanDrosten identifica ainda um terceiro gene que, de acordo com o protocolo da OMS, não foi posteriormente validado e foi considerado desnecessário: “Digno de nota, o ensaio do gene N também teve um bom desempenho, mas não foi submetido a validação adicional intensiva porque era um pouco menos sensível.”

Tratou-se de uma omissão infeliz, pois seria melhor usar todos os três genes no PCR como ensaios de confirmação, e isso teria resultado num protocolo de ferramenta de diagnóstico de detecção de RNA de vírus quase suficiente. Três etapas de teste de confirmação iriam, pelo menos, minimizar erros e incertezas em cada etapa em relação aos pontos “instáveis”. (No entanto, o protocolo ainda ficaria aquém de qualquer “boa prática de laboratório”, tendo em consideração todos os outros erros de projecto).

Tal como está, o ensaio do gene N, lamentavelmente, não é proposto na recomendação da OMS (Figura 1) como uma terceira etapa de confirmação obrigatória e crucial, nem é enfatizado no artigo de CormanDrosten como uma garantia opcional importante “para um fluxo de trabalho de rotina” (Tabela 2).

Consequentemente, em quase todos os procedimentos de teste em todo o mundo, são usadas apenas 2 combinações de Primer, em vez de todas as três. Esse descuido torna todo o protocolo de teste inútil no que diz respeito ao fornecimento de resultados de teste precisos de significado real numa pandemia em curso.

Figura 1: O ensaio confirmatório do N-Gene não é enfatizado como a terceira etapa necessária na recomendação do protocolo oficial da OMS Drosten-Corman [8] nem é exigido como uma etapa crucial para maior precisão do teste na publicação do Eurosurveillance.
Figura 1: O ensaio confirmatório do N-Gene não é enfatizado como a terceira etapa necessária na recomendação do protocolo oficial da OMS Drosten-Corman [8] nem é exigido como uma etapa crucial para maior precisão do teste na publicação do Eurosurveillance.

1c) Conteúdo de GC errado (discutido em 2c, juntamente com a temperatura de recozimento (Tm))

1d) Detecção de genes virais

O RT-PCR não é recomendado para o diagnóstico primário de infecção. É por isso que o Teste RT-PCR usado na rotina clínica para detecção de COVID-19 não é indicado para o diagnóstico de COVID-19 de forma regulamentar.

“Os médicos precisam reconhecer a maior precisão e velocidade das técnicas de diagnóstico molecular para o diagnóstico de infecções, mas também entender as suas limitações. Os resultados laboratoriais devem ser sempre interpretados no contexto da apresentação clínica do paciente, e o local, a qualidade e o momento da colecta da amostra apropriados são necessários para resultados de teste confiáveis ”. [9]

No entanto, pode ser usado para ajudar no diagnóstico diferencial do médico quando ele ou ela tem de discriminar entre as diferentes infecções dos pulmões (Gripe, COVID-19 e SARS têm sintomas muito semelhantes). Para um diagnóstico confirmativo de um vírus específico, devem ser aplicados pelo menos 3 pares de Primers específicos para detectar 3 genes específicos do vírus. De preferência, esses genes alvo devem estar localizados com a maior distância possível no genoma viral (extremidades opostas incluídas). Embora o artigo de CormanDrosten descreva 3 Primers, esses Primers cobrem apenas cerca de metade do genoma do vírus. Este é outro factor que diminui a especificidade para a detecção de RNA do vírus COVID-19 intacto e aumenta a cotação de resultados de teste falso-positivos.

Portanto, mesmo se obtivermos três sinais positivos (ou seja, os três pares de Primers fornecem 3 produtos de amplificação diferentes) numa amostra, isso não prova a presença de um vírus. Um projecto de Primer de melhor qualidade teria Primers terminais em ambas as extremidades do genoma viral. Isso ocorre porque todo o genoma viral seria coberto e três sinais positivos podem discriminar melhor entre um vírus completo (e, portanto, potencialmente infeccioso) e genomas virais fragmentados (sem potência infecciosa). A fim de inferir algo significativo sobre a infectividade do vírus, o gene Orf1, que codifica a enzima replicase essencial dos vírus SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2, deveria ter sido incluído como um alvo (Figura 2). O posicionamento dos alvos na região do genoma viral que é mais pesada e variavelmente transcrita é outra fraqueza do protocolo.

Kim et al. (2020) demonstraram uma expressão 3′ altamente variável de RNA subgenómico no SARS-CoV-2. [23] Esses RNAs são activamente monitorizados como assinaturas para pacientes assintomáticos e não infecciosos. [10] É altamente questionável rastrear uma população de pessoas assintomáticas com Primers qPCR que têm 6 pares de bases Primer-dímero na extremidade de um Primer de 3 Primers (Figura 3). Aparentemente, a OMS recomenda esses Primers. O grupo testou todos os derivados de oscilação do artigo CormanDrosten com a ferramenta de dímero de Primer da Web do Thermofisher. [11] O iniciador direto RdRp tem homologia de 3’Primer de 6bp com Sarbeco E Reverse. Em altas concentrações de Primer, isso é suficiente para criar imprecisões.

Digno de nota: há uma combinação perfeita de um dos iniciadores N com um patógeno clínico (Pantoea), encontrado em pacientes imunocomprometidos. O Primer reverso atinge Pantoea também, mas não na mesma região (Figura 3).

Esses são erros graves de design, uma vez que o teste não pode discriminar entre o vírus inteiro e os fragmentos virais. O teste não pode ser usado como diagnóstico para vírus SARS-CoV-2.

Figura 2: Posições relativas de alvos de Amplicon no coronavírus SARS-CoV-1 e no novo genoma de coronavírus 2019. ORF: quadro de leitura aberto; RdRp: RNA polimerase dependente de RNA. Os números abaixo do Amplicon são as posições do genoma de acordo com SARS-CoV-1, NC_004718 [1]
Figura 2: Posições relativas de alvos de Amplicon no coronavírus SARS-CoV-1 e no novo genoma de coronavírus 2019. ORF: quadro de leitura aberto; RdRp: RNA polimerase dependente de RNA. Os números abaixo do Amplicon são as posições do genoma de acordo com SARS-CoV-1, NC_004718 [1]
Figura 3: Um teste com a ferramenta Web de dímero de Primer da Thermofischer revela que o Primer directo RdRp tem uma homologia de 6bp 3`prime com Sarbeco E Reverse (caixa à esquerda) Outro teste revela que há uma combinação perfeita de um dos N-primers para um patógeno clínico (Pantoea) encontrado em pacientes imunocomprometidos (quadro à direita).
Figura 3: Um teste com a ferramenta Web de dímero de Primer da Thermofischer revela que o Primer directo RdRp tem uma homologia de 6bp 3`prime com Sarbeco E Reverse (caixa à esquerda) Outro teste revela que há uma combinação perfeita de um dos N-Primers para um patógeno clínico (Pantoea) encontrado em pacientes imunocomprometidos (quadro à direita).

2. Temperaturas de reação

2a) Temperatura de fusão do DNA (> 92 °): Abordado adequadamente no artigo CormanDrosten.

2b) Temperatura de amplificação do DNA: Abordado adequadamente no artigo CormanDrosten.

2c) Teores de GC e Tm errôneos

A temperatura de recozimento determina em qual temperatura o Primer se liga / desliga da sequência alvo. Para uma amplificação eficiente e específica, o conteúdo de GC dos Primers deve atingir um mínimo de 40% e um máximo de 60% de amplificação. Conforme indicado na Tabela 3, três dos Primers descritos no artigo CormanDrosten não estão dentro da faixa normal de conteúdo de GC. Dois Primers (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R) têm valores de GC incomuns e muito baixos de 28% – 31% para todas as variantes possíveis de bases de oscilação, enquanto o Primer E_Sarbeco_F tem um valor de GC de 34,6% (Tabela 3 e segundo painel da Tabela 3).

Deve-se notar que o conteúdo de GC determina em grande parte a ligação ao seu alvo específico devido às suas três ligações de hidrogénio no par de bases. Assim, quanto menor o conteúdo de GC do iniciador, menor a sua capacidade de ligação à sua sequência de gene alvo específico (ou seja, o gene a ser detectado). Isso significa que para uma sequência-alvo ser reconhecida, temos que escolher uma temperatura que seja o mais próxima possível da temperatura de recozimento real (valor de prática recomendada) para que o Primer não se desprenda novamente, enquanto, ao mesmo tempo, selecionamos especificamente a sequência alvo.

Se o valor de Tm for muito baixo, conforme observado para todas as variantes oscilantes dos Primers reversos RdRp, os Primers podem ligar-se não especificamente a vários alvos, diminuindo a especificidade e aumentando os potenciais resultados falsos positivos.

A temperatura de recozimento (Tm) é um factor crucial para a determinação da especificidade / precisão do procedimento qPCR e essencial para avaliar a precisão dos protocolos qPCR. Prática recomendada: Ambos os Primers (directo e reverso) devem ter um valor quase semelhante, de preferência o valor idêntico.

O grupo utilizou o Software de design de Primer disponível gratuitamente Primer-BLAST [12][25] para avaliar os valores de melhores práticas para todos os Primers usados no trabalho de CormanDrosten (Tabela 3). O grupo tentou encontrar um valor Tm de 60°C, ao mesmo tempo em que buscou o maior valor de percentagem de GC possível para todos os Primers. Foi considerada aceitável uma diferença máxima de Tm de 2°C dentro dos pares de Primers. Testando os pares de Primers especificados no artigo de CormanDrosten, observou-se uma diferença de 10°C em relação à temperatura de recozimento Tm para o par de Primer 1 (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R). Trata-se de um erro muito grave e torna o protocolo inútil como ferramenta diagnóstica específica.

Testes adicionais demonstraram que apenas o par de Primers projectado para amplificar o gene N (N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R) atingiu o padrão adequado para operar num teste diagnóstico, uma vez que possui conteúdo GC suficiente e a diferença de Tm entre os Primers (N_Sarbeco_F e N_Sarbeco_R) é 1,85°C (abaixo do máximo crucial de diferença de 2°C). É importante ressaltar que esse é o gene que não foi testado nas amostras de vírus (Tabela 2) nem enfatizado como teste confirmatório. Além das temperaturas de fusão altamente variáveis e sequências degeneradas nesses Primers, há outro factor que afeta a especificidade do procedimento: os dNTPs (0,4uM) são 2x mais altos do que o recomendado para uma amplificação altamente específica. Há sulfato de magnésio adicional adicionado à reacção também. Este procedimento combinado com uma baixa temperatura de recozimento pode criar amplificações não específicas. Quando magnésio adicional é necessário para qPCR, a especificidade do ensaio deve ser examinada posteriormente.

Os erros de projecto aqui descritos são tão graves que é altamente improvável que ocorra a amplificação específica do material genético SARS-CoV-2 utilizando o protocolo do artigo CormanDrosten.

Tabela 3: Conteúdo de GC dos Primers e sondas (adaptado do artigo de Corman-Drosten; são destacadas as aberrações de conteúdos de GC optimizados. O segundo painel mostra uma tabela de listagem de todos os valores das melhores práticas (do Prof. Dr. Ulrike Kämmerer e da sua equipa) de Primer-BLAST para todos os Primers e sondas usados no artigo Corman-Drosten.
Tabela 3: Conteúdo de GC dos Primers e sondas (adaptado do artigo de Corman-Drosten; são destacadas as aberrações de conteúdos de GC optimizados. O segundo painel mostra uma tabela de listagem de todos os valores das melhores práticas (do Prof. Dr. Ulrike Kämmerer e da sua equipa) de Primer-BLAST para todos os Primers e sondas usados no artigo Corman-Drosten.

3. O número de ciclos de amplificação

Deve-se notar que não há menção em qualquer lugar no artigo de CormanDrosten de um teste ser positivo ou negativo, ou mesmo o que define um resultado positivo ou negativo. Esses tipos de testes de diagnóstico virológico devem ser baseados num POP, incluindo um número fixo e validado de ciclos de PCR (valor Ct) após o qual uma amostra é considerada positiva ou negativa. O valor Ct máximo razoavelmente confiável é de 30 ciclos. Acima de um Ct de 35 ciclos, deve ser esperado um número crescente de falsos positivos.

Os dados de PCR avaliados como positivos após um valor Ct de 35 ciclos não são confiáveis.

Citando Jaafar et al. (2020) [3]: “Quando Ct = 35, o valor que usamos para relatar um resultado positivo para PCR, < 3% das culturas são positivas.” Por outras palavras, não houve isolamento do vírus SARS-CoV-2 com sucesso nos referidos valores elevados de Ct.

Além disso, estudos científicos mostram que apenas vírus não infecciosos (“mortos” / inactivos) são detectados com valores de Ct de 35. [22]

Entre 30 e 35 há uma área cinzenta, onde um teste positivo não pode ser estabelecido com certeza. Esta área deve ser excluída. Claro, pode realizar-se 45 ciclos de PCR, conforme recomendado no protocolo da OMS de CormanDrosten (Figura 4), mas também se deve definir um valor Ct razoável (que não deve exceder 30). Mas um resultado analítico com um valor Ct de 45 é cientificamente e diagnosticamente, absolutamente sem sentido (um valor Ct razoável não deve exceder 30). Tudo isso deve ser comunicado com muita clareza. É um erro significativo que o artigo de CormanDrosten não mencione o valor Ct máximo no qual uma amostra pode ser considerada inequivocamente como um resultado de teste positivo ou negativo. Este importante limite de ciclo também não foi especificado em nenhuma submissão de acompanhamento até ao momento.

Figura 4: Recomendação do kit RT-PCR no protocolo oficial da OMS de Corman-Drosten. [8] Apenas um valor (ciclos) “Cycler” deve ser encontrado sem Ct (valor de corte) correspondente e cientificamente razoável. Não se encontra este ou qualquer outro valor de ciclo em qualquer documento real de Corman-Drosten.
Figura 4: Recomendação do kit RT-PCR no protocolo oficial da OMS de Corman-Drosten. [8] Apenas um valor (ciclos) “Cycler” deve ser encontrado sem Ct (valor de corte) correspondente e cientificamente razoável. Não se encontra este ou qualquer outro valor de ciclo em qualquer documento real de Corman-Drosten.

4. Validações biomoleculares

Para determinar se os produtos amplificados são de fato genes SARS-CoV-2, a validação biomolecular dos produtos amplificados de PCR é essencial. Para um teste de diagnóstico, esta validação é uma necessidade absoluta.

A validação dos produtos de PCR deve ser realizada executando o produto de PCR num gel de agarose-EtBr a 1% juntamente com um indicador de tamanho (régua de DNA ou escada de DNA) para que o tamanho do produto possa ser estimado. O tamanho deve corresponder ao tamanho calculado do produto de amplificação. Mas é ainda melhor sequenciar o produto de amplificação. Este último dará 100% de certeza sobre a identidade do produto de amplificação. Sem a validação molecular, não se pode ter certeza sobre a identidade dos produtos de PCR amplificados. Considerando os graves erros de projecto descritos anteriormente, os produtos de PCR amplificados podem ser qualquer coisa.

Também não mencionado no artigo CormanDrosten é o caso de pequenos fragmentos de qPCR (em torno de 100pb): pode ser gel de agarose 1,5% ou mesmo um gel de acrilamida. O facto desses produtos de PCR não terem sido validados ao nível molecular é outro erro marcante do protocolo, tornando qualquer teste baseado nele inútil como uma ferramenta diagnóstica específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

5. Controlos positivos e negativos para confirmar / refutar a detecção de vírus específicos

A suposição não confirmada descrita no artigo de CormanDrosten é que o SARS-CoV-2 é o único vírus do grupo do beta-coronavírus semelhante ao SARS que atualmente causa infecções em humanos. As sequências nas quais o seu método de PCR se baseia são sequências in silico, fornecidas por um laboratório na China, [23] porque no momento do desenvolvimento do teste de PCR não estava disponível para os autores material de controlo de SARS-CoV-2 infeccioso (“vivo”) ou inactivado. O teste de PCR foi, portanto, projectado utilizando a sequência do conhecido SARS-CoV-1 como um material de controlo para o componente Sarbeco (Dr. Meijer, co-autor do artigo CormanDrosten em uma troca de e-mail com o Dr. Peter Borger). [2]

Todos os indivíduos com resultado positivo no teste de RT-PCR, conforme descrito no artigo CormanDrosten, são considerados positivos para infecções por SARS-CoV-2. Existem três falhas graves na sua suposição. Em primeiro lugar, um teste positivo para as moléculas de RNA descritas no artigo CormanDrosten não pode ser equiparado a “infecção por um vírus”. Um teste de RT-PCR positivo indica apenas a presença de moléculas de RNA viral. Conforme demonstrado no ponto 1d (acima), o teste CormanDrosten não foi projectado para detectar o vírus de tamanho completo, mas apenas um fragmento do vírus. Já concluímos que isso classifica o teste como inadequado como teste de diagnóstico para infecções pelo vírus da SARS.

Em segundo lugar e de grande relevância, a funcionalidade do teste RT-PCR publicado não foi demonstrada com o uso de um controlo positivo (RNA isolado do SARS-CoV-2), que é o padrão-ouro científico essencial.

Terceiro, o artigo CormanDrosten afirma:

“Para mostrar que os ensaios podem detectar outros vírus relacionados à SARS associados a morcegos, usamos o ensaio do gene E para testar seis amostras fecais derivadas de morcegos disponíveis em Drexler et al. […] e Muth et al. […]. Essas amostras positivas para vírus provieram de morcegos rinolofídeos europeus. A detecção desses outliers filogenéticos dentro do clado CoV relacionado ao SARS sugere que todos os vírus asiáticos provavelmente serão detectados. Isso, teoricamente, garantiria ampla sensibilidade, mesmo no caso de várias aquisições independentes de vírus variantes de um reservatório animal.”

Esta declaração demonstra que o gene E usado no teste de RT-PCR, conforme descrito no artigo de CormanDrosten, não é específico para SARS-CoV-2. Os Primers do gene E também detectam um amplo espectro de outros vírus SARS.

O genoma do coronavírus é o maior de todos os vírus de RNA que infectam os humanos e todos eles têm uma estrutura molecular muito semelhante. Ainda assim, o SARS-CoV-1 e o SARS-CoV-2 têm duas impressões digitais genéticas altamente específicas, que os diferenciam dos outros coronavírus. Primeiro, uma sequência de impressão digital única (KTFPPTEPKKDKKKK) está presente na proteína N do SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2. [13][14][15] Em segundo lugar, tanto o SARS-CoV-1 quanto o SARS-CoV-2 não contêm a proteína HE, enquanto todos os outros coronavírus possuem esse gene. [13][14] Portanto, para detectar especificamente um produto de PCR SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2, a região acima no gene N deveria ter sido escolhida como o alvo de amplificação. Um teste diagnóstico confiável deve se concentrar nesta região específica no gene N como um teste confirmatório. O PCR para este gene N não foi posteriormente validado nem recomendado como um gene de teste pelo artigo de DrostenCorman, por ser “não tão sensível” com a sonda original SARS-CoV. [1]

Além disso, a ausência do gene HE no SARS-CoV-1 e no SARS-CoV-2 torna esse gene o controlo negativo ideal para excluir outros coronavírus. O artigo CormanDrosten não contém esse controlo negativo, nem contém nenhum outro controlo negativo. O teste de PCR no artigo de CormanDrosten, portanto, não contém nem um controlo positivo único nem um controlo negativo para excluir a presença de outros coronavírus. Esta é outra grande falha de projecto que classifica o teste como impróprio para diagnóstico.

6. Não foi disponibilizado um Procedimento Operacional Padrão (POP)

Deveria ter sido disponibilizado um Procedimento Operacional Padrão (POP), que especificasse inequivocamente os parâmetros acima, de modo que todos os laboratórios fossem capazes de configurar as mesmas condições de teste de forma idêntica. Ter um POP universal validado é essencial, pois facilita a comparação de dados dentro e entre países. É muito importante especificar todos os parâmetros do Primer de forma inequívoca. Nota-se que isso não foi feito. Além disso, não é especificado o valor Ct para indicar quando uma amostra deve ser considerada positiva ou negativa. Também não é especificado quando uma amostra é considerada infectada com o vírus SARS-CoV. Como evidenciado acima, o teste não pode discernir entre vírus e fragmentos de vírus, então o valor Ct que indica a positividade é crucialmente importante. Este valor Ct deve ter sido especificado no POP e colocado on-line para que todos os laboratórios que realizam este teste tenham exactamente as mesmas condições. Tudo aponta para uma ciência falha. Os laboratórios são, portanto, livres para conduzir o teste conforme considerem apropriado, resultando numa enorme quantidade de variações. Os laboratórios de toda a Europa ficam com uma infinidade de perguntas: que Primers pedir? Que nucleotídeos preencher nos lugares indefinidos? Que valor de Tm escolher? Quantos ciclos de PCR devem ser executados? Em que valor Ct a amostra pode ser considerada positiva? E quando é negativa? Quantos genes testar? Todos os genes devem ser testados ou apenas o gene E e RpRd, conforme apresentado na Tabela 2 do artigo de CormanDrosten? O gene N deve ser também testado? E qual é o seu controlo negativo? Qual é o seu controlo positivo? O protocolo descrito é, infelizmente, muito vago e errôneo, podendo seguir por dezenas de direcções diferentes. Não parece haver nenhuma padronização nem um POP, por isso, não está claro como pode este teste ser implementado.

7. Consequências dos erros descritos nos pontos 1 a 5: falsos positivos

O teste RT-PCR descrito no artigo de CormanDrosten contém tantos erros ao nível do projecto biológico molecular (ver 1 a 5) que não é possível obter resultados inequívocos. É inevitável que esse teste gere um número enorme dos chamados “falsos positivos”. Falsos positivos são resultados de teste positivos errôneos, ou seja, amostras negativas com teste positivo. E isso é de facto o que se encontra no artigo de CormanDrosten. Na página 6 do manuscrito PDF, os autores demonstram que, mesmo em condições de laboratório bem controladas, uma percentagem considerável de falsos positivos é gerada com este teste:

“Em quatro reações de teste individuais, foi observada uma reactividade inicial fraca, no entanto, elas foram negativas após o reteste com o mesmo ensaio. Esses sinais não foram associados a nenhum vírus em particular e, para cada vírus com o qual ocorreu a reactividade positiva inicial, havia outras amostras que continham o mesmo vírus numa concentração mais alta, mas sem resultado positivo. Dados os resultados da extensa qualificação técnica descrita acima, concluiu-se que essa reactividade inicial não foi devido à instabilidade química das sondas PCR em tempo real mas muito provavelmente aos problemas de manuseio causados ​​pela rápida introdução de novos testes diagnósticos e controlos durante o estudo desta avaliação.” [1]

A primeira frase deste trecho é uma evidência clara de que o teste PCR descrito no artigo de CormanDrosten gera falsos positivos. Mesmo sob as condições bem controladas do laboratório Charité de última geração, 4 de 310 testes primários são falsos positivos por definição. Quatro amostras negativas testaram inicialmente positivas, depois foram negativas no novo teste. Este é o exemplo clássico de um falso positivo. Nesse caso, os autores não os identificam como falsos positivos, o que é intelectualmente desonesto.

Outra observação reveladora no excerto acima é que os autores explicam os falsos positivos como “problemas de manuseio causados pela rápida introdução de novos testes diagnósticos”. Imagine os laboratórios que têm de introduzir o teste sem todas as informações necessárias normalmente descritas num POP.

8. O artigo CormanDrosten não foi revisto por pares

Antes da publicação formal num periódico académico, os artigos científicos e médicos são tradicionalmente certificados por “revisão por pares”. Nesse processo, os editores da revista recebem conselhos de vários especialistas (“árbitros”) que avaliam o artigo e podem identificar deficiências nos seus pressupostos, métodos e conclusões. Normalmente, uma revista só publicará um artigo quando os editores tiverem satisfeito o pressuposto de que os autores tenham abordado as preocupações dos revisores e que os dados apresentados apoiem as conclusões retiradas do artigo. Este processo é também descrito pela Eurosurveillance. [16]

O artigo CormanDrosten foi submetido no Eurosurveillance em 21 de Janeiro de 2020 e aceite para publicação em 22 de Janeiro de 2020. Em 23 de Janeiro de 2020, o artigo estava on-line. Em 13 de Janeiro de 2020, a versão 1.0 do protocolo foi publicada no site oficial da OMS, [17] actualizado em 17 de Janeiro de 2020 como versão do documento 2.1, [18] antes mesmo do artigo de CormanDrosten ter sido publicado em 23 de Janeiro na Eurosurveillance.

Normalmente, a revisão por pares é um processo demorado, pois pelo menos dois especialistas da área precisam ler e comentar criticamente o artigo enviado. Na opinião do grupo, este artigo não foi revisto por pares. Vinte e quatro horas simplesmente não são suficientes para realizar uma revisão completa por pares. Esta conclusão é apoiada pelo facto de que foram encontradas um número enorme de falhas sérias de projecto, o que torna o teste PCR completamente inadequado como ferramenta de diagnóstico para identificar o vírus SARS-CoV-2. Qualquer biólogo molecular familiarizado com o projecto RT-PCR teria facilmente observado os graves erros presentes no artigo de CormanDrosten antes do processo de revisão real. O grupo pediu ao Eurosurveillance em 26 de Outubro de 2020 para lhes enviar uma cópia do relatório de revisão por pares. Até à data, o relatório não foi enviado e, numa carta datada de 18 de Novembro de 2020, o ECDC como anfitrião do Eurosurveillance recusou-se a fornecer o acesso sem fornecer razões científicas substanciais para a sua decisão. Pelo contrário, escreveram que “a divulgação prejudicaria o propósito das investigações científicas”. [24]

9. Autores como editores

Um último ponto que também é de grande preocupação: acontece que dois autores do artigo CormanDrosten, Christian Drosten e Chantal Reusken, também são membros do conselho editorial deste periódico. [19] Portanto, há um grave conflito de interesses que reforça as suspeitas de que o artigo não foi revisto por pares. Parece evidente que a rapidez da publicação foi possível simplesmente porque os autores também faziam parte do conselho editorial do Eurosurveillance. Essa prática é categorizada como comprometendo a integridade científica.

Resumo de erros graves encontrados no artigo

O artigo Corman-Drosten contém os seguintes erros específicos:

1. Não existe nenhuma razão especificada para usar essas concentrações extremamente altas de Primers neste protocolo. As concentrações descritas levam a ligações inespecíficas aumentadas e amplificações de produtos de PCR, tornando o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

2. Seis posições instáveis não especificadas introduzem uma enorme variabilidade nas implementações deste teste de laboratório no mundo real; a descrição inespecífica confusa no artigo CormanDrosten não é adequada como um protocolo operacional padrão, tornando o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

3. O teste não pode descriminar entre o vírus inteiro e os fragmentos virais. Portanto, o teste não pode ser usado como um diagnóstico para vírus intactos (infecciosos), tornando o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2 e fazer inferências sobre a presença de uma infecção.

4. Uma diferença de 10°C em relação à temperatura de recozimento Tm para o par de Primer 1 (RdRp_SARSr_F e RdRp_SARSr_R) também torna o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

5. Outro erro grave é a omissão de um valor Ct no qual uma amostra é considerada positiva ou negativa. O valor de Ct também não é encontrado em submissões de acompanhamento, tornando o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

6. Os produtos de PCR não foram validados a nível molecular. Esse facto torna o protocolo inútil como ferramenta diagnóstica específica para a identificação do vírus SARS-CoV-2.

7. O teste de PCR não contém um controlo positivo único para avaliar a sua especificidade para SARS-CoV-2 nem um controlo negativo para excluir a presença de outros coronavírus, tornando o teste inadequado como ferramenta diagnóstica específica para identificar o SARS-CoV-2 vírus.

8. O design do teste no artigo de CormanDrosten é tão vago e falho que pode-se seguir dezenas de direções diferentes; nada é padronizado e não há POP. Isso questiona fortemente a validade científica do teste e torna-o inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

9. Muito provavelmente, o artigo CormanDrosten não foi revisto por pares, tornando o teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.

10. Encontramos graves conflitos de interesse em pelo menos quatro autores, além do facto de dois dos autores do artigo de CormanDrosten (Christian Drosten e Chantal Reusken) serem membros do conselho editorial do Eurosurveillance. Um conflito de interesses foi adicionado em 29 de Julho de 2020 (Olfert Landt é CEO da TIB-Molbiol; Marco Kaiser é investigador sénior da GenExpress e actua como consultor científico para a TIB-Molbiol), que não foi declarado na versão original (e ainda está ausente na versão PubMed); A TIB-Molbiol é a empresa que foi “a primeira” a produzir kits de PCR (Light Mix) com base no protocolo publicado no manuscrito CormanDrosten e, de acordo com as suas próprias palavras, distribuíram esses kits de teste de PCR antes mesmo da publicação ter sido submetida; [20] além disso, Victor Corman e Christian Drosten não mencionaram a sua segunda afiliação: o laboratório de testes comerciais “Labor Berlin”. Lá, ambos são responsáveis ​​pelo diagnóstico de vírus [21] e a empresa actua no ramo de testes de PCR em tempo real.

Conclusão

À luz do aqui exposto exame do protocolo de teste para identificar o SARS-CoV-2 descrito no documento CormanDrosten, foram identificados erros e falácias inerentes que tornam o teste de PCR SARS-CoV-2 inútil.

A decisão sobre quais os protocolos de teste que foram publicados e amplamente disponíveis está inteiramente nas mãos da Eurosurveillance. A decisão de reconhecer os erros aparentes no artigo CormanDrosten tem o benefício de minimizar significativamente o custo humano e o sofrimento no futuro. Não é do interesse da Eurosurveillance retirar este documento? A conclusão parece ser clara. diante de todas as tremendas falhas e erros de projecto do protocolo de PCR aqui descritos, não há muita escolha no âmbito da integridade e responsabilidade científica.

Autores do grupo que examinou o artigo Corman-Drosten

1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), Molecular Genetics, W + W Research Associate, Lörrach, Alemanha.

2) Rajesh Kumar Malhotra (Artist Alias: Bobby Rajesh Malhotra), Ex-Artista 3D / Visualizações Científicas no CeMMCentro de Medicina Molecular da Academia Austríaca de Ciências (20192020), Universidade de Artes AplicadasDepartamento de Artes Digitais de Viena, Áustria.

3) Dr. Michael Yeadon BSs (Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacology U Surrey. Director administrativo, Yeadon Consulting Ltd, ex-cientista-chefe da Pfizer, Reino Unido.

4) Dra. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Reino Unido.

5) Kevin McKernan, BS Emory University, Chief Scientific Officer, fundador da Medical Genomics, projectou o pipeline de sequenciamento na WIBR / MIT para o Projeto Genoma Humano, inventou e desenvolveu o sequenciador SOLiD, recebeu patentes relacionadas a PCR, isolamento e sequenciamento de DNA, EUA.

6) Prof. Dr. Klaus Steger, Departamento de Urologia, Urologia Pediátrica e Andrologia, Andrologia Molecular, Centro de Pesquisa Biomédica da Universidade Justus Liebig, Giessen, Alemanha.

7) Dr. Paul McSheehy (BSc, PhD), Bioquímico e Farmacologista da Indústria, Loerrach, Alemanha.

8) Dra. Lidiya Angelova, MSc em Biologia, PhD em Microbiologia, Ex-pesquisadora do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID), Maryland, EUA.

9) Dr. Fabio Franchi, Ex-Dirigente Médico (M.D) numa enfermaria de doenças infecciosas, especializado em “doenças infecciosas” e “higiene e medicina preventiva”, Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Itália.

10) Dr. Thomas Binder, Internista e Cardiologista (FMH), Suíça.

11) Prof. Dr. Henrik Ullrich, especialista em Radiologia Diagnóstica, Médico Chefe do Centro de Radiologia do Collm Oschatz-Hospital, Alemanha.

12) Prof. Dr. Makoto Ohashi, Professor emérito, PhD em Microbiologia e Imunologia, Universidade Tokushima, Japão.

13) Dr. Stefano Scoglio, B.Sc. Ph.D., Microbiologista, Nutricionista, Itália.

14) Dr. Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), especialista em Medicina Laboratorial (química clínica), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Holanda.

15) Dra. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD em Química Ambiental e Toxicologia. DGI Consulting Services, Oslo, Noruega.

16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Departamento de Radiação Oncológica, Hospital Leopoldina Schweinfurt, Alemanha.

17) Dra. Ruth Schruefer, PhD, genética humana / imunologia, Munique, Alemanha.

18) Dra. Berber W. Pieksma, clínica geral, Holanda.

19) Dr. Jan Bonte (GJ), Neurologista Consultor, Holanda.

20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (biólogo molecular), especialista em IP, BDC Basel, Suíça.

21) Dr. Kevin P. Corbett, MSc em Enfermagem (Kings College London) PhD (London South Bank) Ciências Sociais (Estudos de Ciência e Tecnologia ) Londres, Inglaterra, Reino Unido.

22) Prof. Ulrike Kämmerer, especialista em Virologia / Imunologia / Biologia Humana / Biologia Celular, Hospital Universitário de Würzburg, Alemanha.

Post Scriptum

Drosten já tinha estado envolvido em investigação relativamente ao PCR aplicado ao SARS  (Síndrome Respiratória Aguda Grave) e MERS (Síndrome Respiratória do Médio Oriente). [26]

Apesar de defender uma boa fiabilidade do teste para o SARS-CoV-2, Drosten parece ter dado uma volta de 180º relativamente à sua opinião anterior, pelo que nos é dado entender através de uma entrevista que deu em 2014[27]

“O método é tão sensível que pode detectar uma única molécula genética desse vírus. Onde anteriormente eram relatados doentes terminais, agora de repente, são incluídos nas estatísticas casos leves e pessoas estão saudáveis. Tal poderá explicar a explosão do número de casos [de MERS] na Arábia Saudita. Para isso também contribuiu o alarmismo dos Meios de Comunicação Social.”

O Paradigmas já tinha publicado um estudo sobre os problemas estatísticos apresentados pelo PCR aplicado ao SARS-CoV-2. [28]

O grupo de cientistas que publicou esta revisão do artigo CromanDrosten criou um site que além do relatório, em si, disponibiliza mais informações. [29]

Fontes:

[1] Corman et al. (2020). Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 Jan 23; 25(3): 2000045. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[2] Comunicação por e-mail entre o Dr. Peter Borger e o Dr. Adam Meijer: Material Suplementar.

[3] Jafaar et al., Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction–Positives Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates

[4] BBC, 21 de Janeiro de 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836; arquivo: https://archive.is/0qRmZ

[5] Google Analytics – COVID19-deaths worldwide: https://bit.ly/3fndemJ; arquivo: https://archive.is/PpqEE

[6] Laboratory testing for COVID-19 Emergency Response Technical Centre, NIVD under China CDC. 15 de Março 2020.

[7] Real-Time PCR Handbook Life Technologies

Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. (2013). Good practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR).

[8] Trestan Pillonel et al (2020). Letter to the editor: SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR.

[9] Kurkela, Satu & David WG Brown (2009). “Molecular-diagnostic techniques.” Medicine 38.10 (2009): 535-540.

[10] Nature, 581, p. 465–469.Wolfel et al. (2020). Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature, 581, p. 465–469. 

[11] Thermofischer Primer Dimer Web Tool

[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information

[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. The Genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science 300(5624): 1399-1404.

[14] Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome.

[15] Borger P. A SARS-like Coronavirus was expected but nothing was done to be prepared. Am J Biomed Sci Res 2020.

[16] Eurosurveillance paper evaluation / review process.

[17] Official recommendation of the Corman-Drosten protocol & manuscript by the WHO, publicado em 13 de Janeiro de 2020 como versão 1 do Documento.

[18] Official WHO-recommendation for the Corman / Drosten RT-qPCR-protocol, which directly derives from the Eurosurveillance-publication, document-version 2-1, publicado na Review Report – Corman-Drosten et al., Eurosurveillance 2020, 17 de Janeiro de 2020.

[19] Eurosurveillance Editorial Board, 2020.

Arquivo: https://bit.ly/2TqXBjX

[20] Instructions For Use LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche Molecular Solutions, 11 de Janeiro de 2020. 

Arquivo de 11 de Janeiro de 2020:  https://archive.is/Vulo5

Arquivo: https://bit.ly/3fm9bXH

[21] Christian Drosten & Victor Corman, responsible for viral diagnostics at Labor Berlin.

Arquivo: archive.is/CDEUG

[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Viral cultures for COVID-19 infectivity assessment. Systematic review. Systematic review doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932

[23] Kim et al. (2020) The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome. Cell, 181, 914–921.

[24] Resposta da ECDC ao Dr. Peter Borger, 18 de Novembro de 2020: Material Suplementar.

[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & team, survey & Primer-BLAST table: Material Suplementar.

[26] Drosten, C. et al. (2004). Evaluation of Advanced Reverse Transcription-PCR Assays and an Alternative PCR Target Region for Detection of Severe Acute Respiratory Syndrome-Associated Coronavirus. DOI: 10.1128/JCM.42.5.2043-2047.2004

[27] „Der Körper wird ständig von Viren angegriffen“. WirtschafrsWoche. 2014.

[28] «Teste PCR: participação na Pandemia da COVID-19.» Paradigmas. 18 de Novembro de 2020.

[29] Corman-Drosten Review Report

DEIXE UMA RESPOSTA

Please enter your comment!
Please enter your name here